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Wirkung von Astrozyten auf die Permeabilität der in vitro BHS

Astrozyten stehen in vivo strukturell und funktionell in enger Wechselwirkung mit den mikrovaskulären Endothelzellen und induzieren durch die Sekretion bislang unbekannter Faktoren viele der spezifischen Eigenschaften der BHS. Auch während der Entwicklung sind Astrozyten an der Differenzierung der Endothelzellen und der Ausbildung der spezifischen Eigenschaften der Gehirnendothelzellen beteiligt.

Glia des Zentralnervensystems: 4 - Endothel; 9 - Ausläufer der Astrozyten; 2 - Neuron

Aus der Abbildung wird erkennbar, dass die Astrozyten mit ihren verschieden langen Ausläufern auf einer Seite die Nervenzellen und auf der anderen Seite, als sogenannte Gefäßfüßchen, die Kapillaren berühren. Sie bedecken ca 80% der Kapillaroberfläche. Die Astrozyten stehen auch selber miteinander in Kontakt (s. Pfeil). Im reifen Gehirn stellen sie somit eine Verbindung zwischen Neuronen und dem Endothel dar.

Daher wird vermutet, dass die spezifischen Eigenschaften der kapillaren Endothelzellen im reifen Gehirn teilweise durch Wechselwirkungen mit den sie umgebenden Astrozyten induziert und erhalten werden. Kokulturversuche von Endothelzellen mit Astrozyten zeigten z.B., dass die Expression spezifischer Enzymaktivitäten des Gehirnendothels wie die der alkalischen Phosphatase und der y-Glutamyltransferase durch die Kokultur erhöht werden kann. Weiterhin wird die Ausbildung der Tight Junctions durch Kokultur mit Astrozyten verstärkt.

Bisher gab es keine Kenntnisse darüber, welchen Effekt Astrozyten auf hypoxiebedingte Permeabilitätsveränderungen ausüben. Bisher wurde lediglich gezeigt, dass Astrozyten einen protektiven Effekt auf Permeabilitätsveränderungen bewirkten, die durch Hypoxie gefolgt von einer Reoxygenierung verursacht wurden. Dabei wirkten die Astrozyten wahrscheinlich als Radikalfänger.

Wir untersuchten die Wirkung der Astrozyten auf hypoxiebedingte Veränderungen der Permeabilität und der VEGF Expression, die, wie bereits gezeigt, für die hypoxiebedingte Hyperpermeabilität verantwortlich war.

Die Astrozyten wurden aus 2Tage alten Ratten mit Hilfe eines Trypsinverdaus isoliert. Für die Versuche wurden auch C6 Glioma Zellen verwendet, wobei es sich um eine Zelllinie mit astrozytischen Eigenschaften handelt.

Für die Kokulturversuche verwendeten wir ein Modell ohne Kontakt. Bei diesem Modell wird nur der Effekt von AS sezernierten Faktoren auf Eigenschaften der Endothelzellen untersucht. Hierbei wird das conditionierte Medium kontinuierlich hergestellt.

Eine 4 tägige Kokultivierung von BMEC mit Astrozyten erhöhte den transendothelialen Widerstande (Maß für die Ionenpermeabilität) über den Endothelzellmonolayer um das doppelte. Der gleiche Effekt wird erkennbar wenn C6 Zellen verwendet wurden.

Der hypoxiebedingte Permeabilitätsanstiege der BMEC, gemessen bis zu 6stündiger Hypoxie, wurde in Gegenwart von AS und C6 Zellen verhindert.

Um zu zeigen, dass dieser Effekt spezifisch für Astrozyten ist, wurden anstelle der Astrozyten glatte Muskelzellen verwendet. Unter diesen Bedingungen wurden die hypoxiebedingten Permeabilitätsveränderungen nicht aufgehoben.

Wirkung von Astrozyten (AS) - und C6-Zellen - konditioniertem Medium auf die Permeabilitätszunahme nach 6stündiger Normoxie und Hypoxie

Da bereits gezeigt wurde, dass Hypoxie bei mikrovaskulären Gehirnendothelzellen eine erhöhte VEGF Expression induziert, wodurch, über eine autokrinen Mechanismus, NO freigesetzt wird, welches die Permeabilität des Endothelzellmonolayers erhöht, wurde auch die Wirkung von Astrozyten- und C6-konditioniertem Medium auf die VEGF Expression untersucht. Sowohl die hypoxieinduzierte mRNA als auch die Proteinexpression von VEGF wurden spezifisch durch konditioniertes Medium von Astrozyten oder C6-Zellen signifikant erniedrigt.

Wirkung von Astrozyten (AS) - und C6-Zellen - konditioniertem Medium auf die VEGF Expression nach 6stündiger Normoxie und Hypoxie

Da VEGF die NO Bildung induzierte, sollte Astrozyten-conditioniertes Medium auch die, unter hypoxischen Bedingungen gebildete NO-Menge reduzieren. Die NO-Bildung wurde indirekt über eine Bestimmung des cyclischen GMP Gehaltes bestimmt. Wie die Abbildung zeigt, wurde der hypoxieinduzierte cGMP Anstieg durch Astrozyten- bzw. C6-conditioniertes Medium erniedrigt.

Wirkung von Astrozyten (AS) - und C6-Zellen - konditioniertem Medium auf die Menge des gebildeten cGMP nach 6stündiger Normoxie und Hypoxie

Zusammenfassend läßt sich sagen, dass Gliazellen einen protektiven Effekt auf die mikrovaskulären Gehirnendothelzellen ausüben, indem sie den hypoxieinduzierten Anstieg der VEGF Expression, die NO Bildung und dadurch auch die hypoxieinduzierten Permeabilitätsveränderungen verhindern 26.

Neuere Ergebnisse zeigen, dass nach 24 stündiger Hypoxie auch die Permeabilität im Kokulturmodell ansteigt, was bedeuten würde, dass durch die Astrozyten der Zusammenbruch der BHS verzögert wird. Möglicherweise sind die Astrozyten dann selber so geschädigt, dass der protektive Effekt während länger andauernder Hypoxie verloren geht.